林可霉素
快速檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
一、原理
試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物林可霉素藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗林可霉素藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留林可霉素藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得出相應(yīng)殘留物林可霉素藥物的含量。
二、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度： 0.1ppb
- 孵育溫度： 25℃
- 孵育時(shí)間： 30min～15min
- 樣本檢測(cè)下限
組 織 ······································ 0.4ppb
飼 料 ······································· 1ppb
蜂 蜜 ······································ 2ppb
- 交叉反應(yīng)率
林可霉素 ···································· 100%
- 樣本回收率
組 織 ······································ 100±25%
飼 料 ······································· 95±25%
蜂 蜜 ······································ 100±25%
三、試劑盒組成
1 | 微量測(cè)試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.1ppb |
0.3ppb | 0.9ppb | ||
2.7ppb | 8.1ppb | ||
3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍(lán)色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 20X濃縮提取液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：?jiǎn)蔚?20～200ul、單道100～1000ul、多道 250ul
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
- 本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、禽類(lèi)和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、兔、魚(yú)、蝦等。
- 實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
- 實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
- 樣本前處理需配制：
配液1 樣本提取液：
將去離子水與20X濃縮提取液按19:1稀釋。
- 樣本前處理方法：
（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚(yú)等）
1、稱(chēng)2.0±0.05g 均質(zhì)的組織樣本于50ml離心管中；
2、加入6ml樣本提取液，振蕩2min，4000r/min以上，15℃離心10min；
3、取上層50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4
（b）飼料樣本
1、稱(chēng)1.0±0.05g 粉碎的飼料樣本于50ml離心管中；
2、加入5ml樣本提取液，振蕩1min，4000r/min以上，15℃離心10min；
3、取上層200µl液體加入200µl樣本提取液，震蕩混勻，取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10
（c）蜂蜜樣本
1、稱(chēng)1.0±0.05g 的蜂蜜樣本于50ml離心管中；
2、加入5ml樣本提取液，振蕩1min，4000r/min以上，15℃離心10min；
3、取上層200µl液體加入600µl樣本提取液，震蕩混勻，取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
- 測(cè)定前應(yīng)須知：
- 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
- 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
- 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
- 所有恒溫孵育過(guò)程，避免光線(xiàn)照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
- 操作步驟：
- 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
- 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。
- 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋?zhuān)?/span>1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
- 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
- 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
- 取出并甩干孔內(nèi)液體；用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
- 測(cè)定：加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定吸光度值（OD值）。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含林可霉素藥物量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130； 0.9ppb為0.635；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中林可霉素藥物的實(shí)際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第--個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中林可霉素藥物實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
八、 注意事項(xiàng)
- 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
- 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
- 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
- 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
- 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。
- 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。
- 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
- 若樣本處理方法中檢測(cè)濃度不在曲線(xiàn)范圍內(nèi)時(shí)，可將樣本稀釋一定倍數(shù)，使其可檢測(cè)范圍在曲線(xiàn)范圍內(nèi)時(shí)檢測(cè)。
- 該試劑盒反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期
- 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
- 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。
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